Anwendung optische Mikroskopie: Fluoreszenz

Autoren: Stephan Briggs

Bei der Fluoreszenzmikroskopie handelt es sich um eine optische Mikroskopietechnik, die die durch Fluorophore hervorgerufene Fluoreszenz nutzt, im Gegensatz zur Absorption, Streuung oder Reflexion. Ein Fluorophor ist ein fluoreszierender Farbstoff, der zur Markierung von Proteinen, Geweben und Zellen für die Untersuchung mittels Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird. Ein Fluorophor funktioniert durch Absorption von Energie bestimmter Wellenlängen, die gemeinhin als Anregungsbereich bezeichnet werden, und durch Wiederabgabe dieser Energie in einem anderen spezifischen Wellenlängenbereich, dem Emissionsbereich.

Fluoreszenzmikroskope können sehr einfach sein, wie z. B. ein Epifluoreszenzmikroskop, oder sehr komplex, wie z. B. konfokale oder Multiphotonen-Systeme. Ob einfach oder komplex, Fluoreszenzmikroskope haben das gleiche Grundkonzept: mit Anregungsenergie wird eine Probe beleuchtet, die dann eine - wenn auch schwache - Wellenlängenenergie aussendet, die quantifizierbar ist. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen haben nicht dieselbe zentrale Wellenlänge, so dass spezielle optische Filter den Gesamtkontrast und das Signal erhöhen können.

Aussehen des Bildes

Abbildung 1 zeigt eine Fluoreszenzprobe aus der Praxis. Die Probe wird durch eine Quelle mit kürzerer Wellenlänge (350 - 500 nm) angeregt und emittiert dann eine Fluoreszenzwellenlänge, die länger ist als die Anregungswellenlänge (500 nm +). Solche Bilder wären nicht möglich ohne die fortschrittlichen optischen Filtertechniken in der Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe derer sich das Licht in schmalen Bandbreiten bis zum Sensor ausbreiten kann, was zu sehr scharfen, kontrastreichen Bildern führt. Fluoreszierende Proteine in den Präparaten bewirken die einzigartigen Emissionsfarben. Diese Proteine, wie z. B. GFP, werden häufig aus dem Meer gewonnen.

Abbildung 1: Fluoreszenzaufnahme von Mikrosphären

Technische Details

Im Allgemeinen entsprechen die technischen Einzelheiten eines Fluoreszenzmikroskops denen eines normalen Mikroskops mit Hellfeldbeleuchtung oder eines Mikroskops mit Dunkelfeldbeleuchtung. Die Innovation liegt in den ausgeklügelten Filtertechniken, mit denen schmale Lichtbänder selektiv genutzt werden. Die drei entscheidenden Filter, die für ein Präzisions-Fluoreszenzmikroskop benötigt werden, sind der Anregungs-, der dichroitische und der Emissionsfilter. Ausführlichere Informationen finden Sie unter Fluorophore und Filter in der Fluoreszenzmikroskopie.

1. Anregungsfilter: wird in den Beleuchtungspfad eines Fluoreszenzmikroskops eingesetzt. Er filtert alle Wellenlängen der Lichtquelle mit Ausnahme des Anregungsbereichs des Fluorophors oder der zu untersuchenden Probe heraus.
2. Dichroitischer Filter: zwischen dem Anregungsfilter und dem Emissionsfilter in einem Winkel von 45° angeordnet. Er reflektiert das Anregungssignal zum untersuchten Fluorophor und überträgt das Emissionssignal zum Detektor.
3. Emissionsfilter: wird in den Abbildungspfad eines Fluoreszenzmikroskops eingesetzt. Er filtert den gesamten Anregungsbereich des untersuchten Fluorophors heraus und überträgt den Emissionsbereich des Fluorophors.

Abbildung 2: Grundlegende optische Filteranordnung für die Fluoreszenzmikroskopie

Weitere Anwendungen der optischen Mikroskopie sind Hellfeldbeleuchtung, Dunkelfeldbeleuchtung, Phasenkontrastmikroskopie und differentielle Interferenzkontrastmikroskopie.