BIOWISSENSCHAFTEN UND MEDIZINPRODUKTE

DURCHFLUSSZYTOMETRIE
 

Optiken für die
Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine Analysetechnik, die in einer Vielzahl biowissenschaftlicher Anwendungen zum Zählen, Prüfen oder Sortieren von Partikeln in Lösung, wie einzelnen Zellen, eingesetzt wird. Mit dieser Technik lassen sich gemischte Zellpopulationen, z. B. aus Blut, Knochenmark oder sogar aus festem Gewebe wie Tumoren analysieren, wenn diese in einzelne Zellen zerlegt werden. Diamit lassen sich schnell und genau eine Vielzahl von Krankheiten diagnostizieren oder Zellen für weitere Analysen sortieren. Die Durchflusszytometrie kommt in zahlreichen Fachgebieten wie der Immunologie, Onkologie, Virologie und Molekularbiologie sowie bei der Überwachung von Infektionskrankheiten zum Einsatz.

Durchflusszytometer sind diagnostische Geräte, die optofluidische Systeme verwenden, bei denen ein oder mehrere Laser auf die zu analysierende Probe fokussiert werden, während die Partikel vorbeifließen. Je nach Partikeleigenschaften (Partikelform, Größe und dem eingesetzten Farbstoff) werden entweder Streu- oder Fluoreszenzlichtsignale erzeugt. Diese Signale gelangen dann über Filter zu dem/den Detektor(en) – in der Regel Fotodioden oder Fotovervielfacher. Der Strahlengang dieser Systeme besteht in der Regel aus Linsen, optischen Filtern, Spiegeln, Prismen und anderen optischen Komponenten, die das Licht lenken. Die beteiligten optischen Komponenten sind entscheidend für die Verbesserung der Genauigkeit dieser Systeme und die erfolgreiche Übertragung des Signals von der Durchflusszelle zu dem/den Detektor(en).

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Blut und Optik

Übersicht: Durchflusszytometrie und typischer Strahlengang

Die Durchflusszytometrie ist die primäre Technologie zur Untersuchung und zum Nachweis von Erkrankungen des Blutes und anderen Körperflüssigkeiten. Ein Durchflusszytometer besteht aus drei wichtigen Teilsystemen: einem Fluidiksystem, einem elektronischen Detektionssystem und einem optischen System.

Durchflusszytometrie
Abbildung 1: Typische Konfiguration eines Durchflusszytometers

Fluidiksystem: Hydrodynamische Fokussierung

Für qualitative Messungen werden hohe Durchflussraten verwendet:

  • Phänotypisierung, d. h. die Vorhersage des Phänotyps eines Organismus ausschließlich anhand genetischer Informationen, die durch DNA-Sequenzierung oder Genotypisierung gewonnen wurden

Höhere Auflösung durch niedrigere Durchflussraten:

  • Zell- und DNA-Analyse

Elektronisches Detektionssystem

Vorwärtsstreulicht: Messung des leicht außerhalb der Laserstrahlachse gestreuten Lichts zur Erkennung von Partikeln bestimmter Größe.

Seitenstreulicht: Die Messung des am stärksten gebrochenen und reflektierten Lichts an einer Grenzfläche in der Zelle, an der sich der Brechungsindex proportional zur Zellkomplexität und Granularität ändert.

Ausrüstung

  • Fotovervielfacher (PMTs): zur Erkennung der schwachen Signale, die durch Seitenstreulicht und Fluoreszenz erzeugt werden
  • Fotodioden: weniger empfindlich als PMTs und zur Erkennung stärkerer Vorwärtsstreulicht-Signale verwendet

Optisches System

Anregungsoptiken: Laser und Linsen zur Formung und Fokussierung des Laserstrahls

Emissionsoptiken: verschiedene Linsen zur Bündelung des Streulichts sowie Spiegel, Filter und Strahlteiler für die richtige Strahlumlenkung.

Fluorophore und Filter für die Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie mehr über die Funktionsweise von Fluorophoren und optischen Filtern für die Fluoreszenzmikrospektroskopie.

Für die Untersuchung, Diagnose und Behandlung von Erkrankungen des Bluts und anderer Körperflüssigkeiten kommen zahlreiche Techniken und Methoden zum Einsatz. Die am häufigsten eingesetzten Verfahren sind die Durchflusszytometrie, Zellsortierung, Optofluidik und Mikroskopie.

Zellsortierung

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein spezieller Zweig der Durchflusszytometrie, bei dem eine heterogene Ansammlung von Zellen aktiv in verschiedene Behälter sortiert wird, und zwar Zelle für Zelle. Dazu werden allgemeine Prinzipien der Lichtstreuung und Fluoreszenz verwendet, die auf den Eigenschaften der jeweiligen Zelle basieren.

Optofluidik

Technologie, die den Bereich der Mikrofluidik mit der Optik verbindet. Zu den Hauptanwendungen gehören Flüssigkristalldisplays, Energietechnik und optische Linsen. Das Hauptaugenmerk von Startup-Unternehmen liegt jedoch auf Lab-on-Chip-Geräten, Biosensoren und molekularen Bildgebungssystemen.

Hochdurchsatz-Screening

Ein leistungsfähiges Verfahren zur Entdeckung von Wirkstoffen, das in der Pharmaindustrie häufig eingesetzt wird. In der Regel handelt es sich um ein automatisiertes Verfahren, das eine schnellere Bereitstellung neuartiger Arzneimittel bei geringerem Risiko für menschliche Fehler ermöglicht.

Mikroskopie

Herkömmliche Lichtmikroskope werden zur Betrachtung von histologischen Präparaten oder präparierten Zellen und Proben verwendet. Höherwertige Mikroskope, so genannte konfokale oder Multiphotonen-Mikroskope, verwenden mehrere Laser, Scannerspiegel, motorisierte Antriebe und eine Reihe von Hochleistungsdetektoren, um intrazelluläre Aktivitäten oder Protein-Protein-Interaktionen besser zu verstehen.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

Eine spezielle Art der Durchflusszytometrie, die die Fluoreszenz- und Streuungseigenschaften biologischer Zellen nutzt, um sie in getrennte Behälter zu sortieren. Mit dieser Technik werden Partikel in einem heterogenes Gemisch eines nach dem anderen getrennt.

Diagnostische Verfahren

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Optische Komponenten sind für viele biowissenschaftliche Anwendungen und medizinische Geräte, einschließlich Durchflusszytometern, von entscheidender Bedeutung. Strahlteiler und verschiedene Arten von Filtern, wie Bandpass-, dichroitische, Langpass- und Kurzpassfilter, sind nur einige der am häufigsten verwendeten Filter.

Bandpassfilter

Bandpassfilter

Optische Bandpassfilter werden verwendet, um einen gewünschten Teil des Spektrums zu transmittieren und gleichzeitig alle anderen Wellenlängen außerhalb des Durchlassbereichs zu unterdrücken.

Abbildung 2 (links): Transmissionsprofil eines Bandpassfilters

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Custom Bandpass Filter

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Abbildung 3: Durch die Kombination eines Kurzpassfilters mit einem Langpassfilter lässt sich ein benutzerdefinierter Bandpassfilter erstellen
Kurzpassfilter

Kurzpassfilter

Optische Kurzpassfilter werden verwendet, um Wellenlängen zu transmittieren, die kürzer sind als die bestimmte Cut-off-Wellenlänge des Filters.

Abbildung 4 (links): Transmissionsprofil eines Bandpassfilters

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Langpassfilter

Langpassfilter

Optische Langpassfilter werden verwendet, um Wellenlängen zu transmittieren, die größer sind als die Grenzwellenlänge des Filters.

Abbildung 5 (links): Transmissionsprofil eines Langpassfilters

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Dichroitische Filter

Dichroitische Filter

Dichroitische Filter reflektieren unerwünschte Wellenlängen und transmittieren gleichzeitig den gewünschten Teil des Spektrums. Dieser Effekt wird dazu verwendet, das Licht wellenlängenabhängig in zwei Pfade aufzuteilen.

Abbildung 6 (rechts): Transmissionsprofil eines dichroitischen Filters

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Strahlteiler

Strahlteiler

Strahlteiler sind optische Komponenten, mit denen einfallendes Licht in einem bestimmten Verhältnis in zwei separate Strahlengänge aufgeteilt wird. Im Gegensatz zu dichroitischen Filtern wird das Eingangslicht nicht nach Wellenlänge getrennt, sondern durch ein bestimmtes Reflexions-/Transmissionsverhältnis wie 50/50 oder 70/30 in zwei Gänge aufgeteilt.

Abbildung 7 (links): Das einfallende Licht wird durch diese Strahlteilerplatte in zwei getrennte Strahlengänge aufgeteilt

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Erkrankungen des Blutes

Im Folgenden sind häufige Erkrankungen des Bluts aufgelistet, die durch moderne diagnostische Verfahren erkannt werden können, beispielsweise durch die Durchflusszytometrie. Dank des Fortschritts in der Optik können diese Krankheiten leichter erkannt und behandelt werden, so dass die Medizintechnik und die Geräte schneller, tragbarer und einfacher zu bedienen sind.

Abbildung 8: Häufige Erkrankungen des Blutes
 
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