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BIOWISSENSCHAFTEN UND MEDIZINPRODUKTE

FLUORESZENZBILDGEBUNG
 

Optiken für die
Fluoreszenzbildgebung

Die Fluoreszenzbildgebung ist eine leistungsstarke, hochempfindliche, nichtinvasive Technik, die in den Biowissenschaften zur Visualisierung und Überwachung biologischer Prozesse in lebenden oder fixierten Zellen, Geweben oder sogar ganzen Organismen eingesetzt wird. Fluoreszenz ist die Emission sichtbarer oder unsichtbarer Strahlung durch eine Substanz wie z. B. einen fluoreszierenden Farbstoff (auch Fluorophore oder Chromophore genannt) bei Anregung durch Licht oder andere elektromagnetische Strahlung. Auf dem Markt ist eine breite Palette von Fluoreszenzfarbstoffen und -proteinen erhältlich, die zur Markierung biologischer Strukturen mit hoher Spezifität verwendet werden können. Fluoreszenzbildgebungstechniken können in spektroskopische und mikroskopische Fluoreszenzmethoden unterteilt werden. Zu den Anwendungen, die auf spektraler Detektion basieren, gehören qPCR, DNA-Sequenzierung, Hochdurchsatz-Screening oder Durchflusszytometrie. Zu den in biomedizinischen Forschungslabors häufig verwendeten Fluoreszenzmikroskopietechniken gehören Epifluoreszenz-, Konfokal-, Multiphotonen-, TIRF- (Total Internal Reflectance Fluorescence), Super-Resolution- (SIM, STORM, PALM, STED) oder Lichtscheibenmikroskopie sowie Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. Welches Verfahren am besten geeignet ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. dem Grad der zwei- oder dreidimensionalen Auflösung, der Bildgebungsgeschwindigkeit, der Bildtiefe und der Anzahl der erforderlichen Farbkanäle, jedoch nutzen alle denselben Fluoreszenzmechanismus zur Beobachtung biologischer Prozesse.

Ein typisches Fluoreszenz-Bildgebungssystem besteht aus den folgenden Komponenten:

  • Anregungsquelle: dies kann eine Breitbandquelle oder eine Schmalbandquelle wie eine LED oder ein Laser sein
  • Optische Komponenten zur Sammlung, Lenkung und Trennung von Licht: Linsen, Spiegel, Prismen, optische Filter
  • Detektor: z. B. Fotodiode, Fotoverfielfacher, CCD- oder CMOS-Kamera

Fluoreszenzfiltersätze sind besonders wichtig, um das Anregungslicht von der emittierten Fluoreszenz zu trennen, und bestehen in der Regel aus einer Kombination von Anregungs- (gewöhnlich Bandpass), dichroitischen (manchmal auch als dichroitischer Spiegel oder dichromatischer Strahlteiler bezeichnet) und Emissionsfiltern (Bandpass oder Langpass) mit Transmissionsprofilen, die für die spektralen Eigenschaften bestimmter Fluorophore optimiert sind.

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Blut und Optik

Konfokale Fluoreszenzmikroskopie - Überblick und typischer Strahlengang

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eines der wichtigsten Verfahren zur Untersuchung der funktionalen oder morphologischen Dynamik synaptischer Strukturen wie dendritischen Dornfortsätze und Endknöpfchen und zur Charakterisierung der Verbindung dieser Schaltkreise und ihrer Dynamik. In der Regel wird ein Laserstrahl als Punktlichtquelle auf eine Lochblende fokussiert. Räumlich gefiltertes Licht wird von einem dichroitischen Filter reflektiert. Um die gesamte Apertur des Objektivs zu füllen, kann ein Strahlaufweiter erforderlich sein. Das Objektiv fokussiert dann Erregerenergie auf die Probe, die ein schwächeres Fluoreszenzsignal aussendet, das vom gleichen Objektiv erfasst wird. Dieses emittierte Licht wird durch den dichroitischen Filter zu einer zweiten Tubuslinse transmittiert und passiert dann eine weitere Lochblende, bevor es durch einen CCD- oder CMOS-Sensor erkannt wird. Im Idealfall befinden sich beide Lochblenden in der konjugierten Bildebene auf der optischen Achse, sodass sich die Bilder in der Objektebene perfekt überlappen. Da die konfokale Mikroskopie einen sehr dünnen, kleinen Bereich der Objektebene beobachtet, muss das Licht über ein Scannersystem oder einen motorisierten Aktuator geleitet werden, um einen ganzen Probenbereich zu erfassen. Die Bilder werden dann als 2D- oder 3D-Bilder zusammengesetzt.

Durchflusszytometrie
Abbildung 1: Grundlegende optische Filteranordnung für die Fluoreszenzmikroskopie

Weitere diagnostische Methoden, die auf Optik basieren

Zahlreiche optikbasierte Diagnoseverfahren werden zur Untersuchung, Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, z. B. des Gehirns, eingesetzt, darunter die laserbasierte Mikroskopie und die Optogenetik.

GFP

Das grün fluoreszierende Protein (GFP) ist ein spezielles Protein, das aus einer spezifischen Gruppe von Aminosäuren besteht und grün leuchtet, wenn es blauem bzw. UV -icht ausgesetzt ist. Dieses Protein wurde aus Meeresquallen extrahiert, die häufigste Erregerwellenlänge liegt bei 395 nm bis 475 nm mit Emissionsspitzen bei 509 nm bis 525 nm. GFP wird bei nichtinvasiven Fluoreszenzbildgebungssystemen häufig eingesetzt, um Tumorwachstum, Apoptose und andere Zellaktivitäten zu erkennen.

Optogenetik

Biologisches Verfahren, bei dem mit Licht Zellen in lebendem Gewebe gesteuert werden, meist Neuronen, die genetisch mit Fotorezeptoren modifiziert wurden und auf verschiedene Wellenbänder reagieren.

CLARITY-Methode

Verfahren, mit dem das Hirngewebe durch Hydrogele transparent gemacht wird. Zusammen mit Antikörpern oder Biomarkern entstehen detailreiche Bilder der Nukleinstruktur des Gehirns, die dann bestimmt und untersucht werden können.

GCaMP

Ein genetisch codierter Kalziumindikator für die Bildgebung des Gehirns. GCaMP ähnelt der Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mit Calmodulin und einer Myosin-Peptid-Sequenz.

Kartierung des Gehirns

Neurowissenschaftliches Verfahren zur Kartierung und Auflistung spezifischer Teile oder Eigenschaften des Gehirns in einer räumlichen Darstellung. Allgemein handelt es sich um Bildgebungsverfahren zur Anatomie und Funktion des Gehirns, des Rückenmarks und des Zentralnervensystems.

Patch Clamp

Elektrophysiologisches Verfahren zur Untersuchung einzelner oder mehrerer Ionenkanäle in Nervenzellen, Herzmuskelzellen, Muskelfasern und anderen Zellen.

Lasermikroskopie

Mikroskopverfahren wie Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie, Multiphotonen- und Super-Resolution- Mikroskopie zur Untersuchung der Synapsen, Neuronen und neuralen Schaltkreise in Hirnschnitten.

Diagnostische Verfahren

Produkt-Spotlight

Bei jedem Mikroskopieverfahren spielen Objektive mit mehreren Elementen eine wichtige Rolle, beispielsweise für viele Hirndiagnoseverfahren. Um für Ihre Anwendung das richtige Objektiv einzusetzen, sollten die verschiedenen Objektivarten bekannt sein.

Endlich korrigierte Objektive

Endlich korrigierte Objektive

Endlich korrigierte Objektive sind Mikroskopobjektive, bei denen keine zweite Linse zur Fokussierung auf eine Probe benötigt wird. Die Objektive sind in der Regel für die Verwendung im sichtbaren Spektrum optimiert und enthalten bis zu vier Linsen.

Abbildung 2: Aufbau eines endlich korrigierten Mikroskopobjektivs

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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

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Unendlich korrigierte Objektive

Unendlich korrigierte Objektive

Unendlich korrigierte Objektive sind Mikroskopobjektive, die im unendlichen Abstand „fokussieren“. Sie haben große Arbeitsabstände und erlauben es, optische Komponenten, beispielsweise optische Linsen oder optische Filter, in den Strahlengang einzusetzen. Unendlich korrigierte Objektive besitzen höhere Auflösungen als endlich korrigierte Objektive, sind aber schwerer und teurer.

Abbildung 3 (links): Aufbau eines unendlich konjugierten (unendlich korrigierten) Mikroskopobjektivs

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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

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Grundlagen zur Auflösung und Vergrößerung unendlich korrigierter Objektive

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Einsatz von Tubuslinsen mit unendlich korrigierten Objektiven

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Spiegelobjektive

Spiegelobjektive

Spiegelobjektive sind Mikroskopobjektive mit zwei Spiegeln, die ein Bild erzeugen oder einen Laser für Mikroskopieanwendungen fokussieren, bei denen eine chromatische Korrektur für ein breites Spektralband benötigt wird.

Abbildung 4: Aufbau eines Spiegelobjektivs

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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

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Grundlagen zu Spiegelobjektiven

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Anspruchsvolle Anwendungen erfordern Spiegelobjektive.

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Achromatische Objektive

Achromatische Objektive

Achromatische Objektive sind Mikroskopobjektive, welche die chromatische Aberration bei blauem und rotem Licht sowie die sphärische Aberration bei grünem Licht korrigieren. Achromatische Objektive sind leichter und kostengünstiger als apochromatische Objektive, jedoch nicht so genau für chromatische Aberration, sphärische Aberration und Feldebenheit korrigiert.

Abbildung 5: Apochromatisches Objektiv (links) und achromatisches Objektiv (rechts)

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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

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Apochromatische Objektive

Apochromatische Objektive

Apochromatische Objektive sind Mikroskopobjektive, die in einem großen Wellenlängenbereich (vom sichtbaren Licht bis zum nahen Infrarotbereich) eine bessere Farbkorrektur als achromatische Objektive sowie eine bessere sphärische Korrektur und Feldebenheit besitzen. Sie sind jedoch schwerer und teurer als achromatische Objektive.

Abbildung 6: Apochromatisches Objektiv (links) und achromatisches Objektiv (rechts)

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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

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Fluoreszenzmikroskopie: In-Line-Beleuchtung mit Bildverarbeitungsfiltern

Weitere Informationen zum Aufbau eines Fluoreszenzmikroskopiesystems.

Kalkulator zur Berechnung der Tubuslänge bei unendlich korrigierten Objektiven

Bestimmen Sie die maximale Tubuslänge, bei der keine Vignettierung auftritt, für ein unendlich korrigiertes Mikroskopsystem und eine bestimmte Bildsensorgröße anhand der Brennweite des Objektivs, der numerischen Apertur des Objektivs, dem Eintrittspupillendurchmesser der Tubuslinse, der Brennweite der Tubuslinse und der Sensorgröße.

Erkrankungen des Gehirns

Im Folgenden sind häufige Erkrankungen des Gehirns aufgelistet, die durch moderne Diagnoseverfahren erkannt werden können, beispielsweise mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Die technischen Fortschritte im Bereich der Mikroskopobjektive und anderen Optikkomponenten erlauben eine leichtere Erkennung und Behandlung dieser Erkrankungen.

Schlaganfall

Erkrankung durch längere Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns, die zu Muskelschwäche in einer Körperhälfte, zum Verlust der Gesichtskontrolle, Taubheit und Sprachproblemen führt.

Alzheimer

Progressive und nicht heilbare Demenz, die das Gedächtnis und andere wichtige mentale Funktionen zerstört, schleichend beginnt und sich allmählich verschlechtert.

Parkinson

Nicht heilbare Störung des zentralen Nervensystems (ZNS), welche die Bewegung beeinträchtigt und ein nicht kontrollierbares Zittern mit sich bringt.

Huntington-Krankheit

Erbliche, nicht heilbare Krankheit, bei der die Nervenzellen im Gehirn im Laufe der Zeit geschädigt werden, sodass es zu ruckartigen Körperbewegungen und schließlich zur Sprachunfähigkeit kommt.

Meningitis

Schwere Entzündung des Gehirns und der Rückenmarkshaut, die in der Regel durch eine Infektion ausgelöst wird und zu Fieber, Kopfschmerzen und Nackensteifheit führt.

Epilepsie

Erkrankung mit wiederkehrenden Krämpfen, hauptsächlich aufgrund abnormer und verstärkter elektrischer Aktivität im Gehirn.

Gehirnerschütterung

Die häufigste Art traumatischer Hirnverletzungen, ausgelöst durch starke Stoßverletzungen mit Gehirnerschütterung oder einer Verschiebung des Gehirns im Schädel.

Hirntumore

Gutartiges oder bösartiges abnormes Zellwachstum unterschiedlicher Art im Gehirn mit unterschiedlichem Schweregrad, beispielsweise Astrozytome, Blastome, Ependymome und Meningiome.

 
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