Fluoreszenzmikroskopie: In-Line-Beleuchtung mit Bildverarbeitungsfiltern

Autoren: Stephan Briggs

Basiskonfiguration | empfohlene Komponenten

Fortschritte in der Kameratechnologie haben die Mikroskopie für Biologie- und Industrieanwendungen revolutioniert. Biologen oder Ingenieure müssen nicht länger stundenlang durch Okulare blicken und ständig nachfokussieren. Heute werden Daten mit digitalen Videomikroskopen aufgezeichnet und analysiert. Allgemeine Informationen zu solchen Systemen finden Sie unter Aufbau von digitalen Videomikroskopen.

Um die Vorteile eines digitalen Videomikroskops zu verdeutlichen, betrachten wir ein System mit koaxialer Beleuchtung und Filter für optimalen Kontrast und eindeutige Quantifizierung der Emission.

Grundlagen der Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie nutzt die Absorption und Emission von Fluorophoren, zusammen mit geeigneter Filterung, um bestimmte Details einer Probe hervorzuheben oder überhaupt erst sichtbar zu machen. Bei einem Fluopreszenzmikroskop mit koaxialer Beleuchtung wird eine Strahlteilerplatte genutzt, um die Beleuchtung in den eigentlichen Strahlengang des Kamerasystems einzukoppeln. Mechanisch ist diese Konfiguration weniger kompliziert als andere digitale Videomikroskope und entspricht im Wesentlichen Abbildung 1. Wie die meisten optischen Systeme besteht dieses System aus einem Sensor, der Optik und einem zu prüfenden Objekt. Hier wird eine CMOS-Farb-USB-Kamera EO-3112C ½" #59-367 zusammen mit dem M-Plan Apo-Objektiv 10X #59-877 von Edmund Optics und der MT-1-Tubuslinse #54-774 eingesetzt. Eine Tubuslinse wie #54-774 wird für unendlich korrigierte Objektive benötigt, um eine Abbildung bei endlichen Abständen zu erzeugen. Das zu prüfende Objekt kann beispielsweise eine biologische Probe, eine Pflanze oder ein Insekt, Materialproben oder ein Testbild sein.

Abb.1: Unendlich korrigiertes digitales Videomikroskop aus sieben Komponenten für die Fluoreszenzmikroskopie

Sobald das eingesetzte Fluorophor und damit die Anregungs- und Emissionswellenlängen feststehen, ist die sorgfältige Auswahl der Filter der nächste Schritt. Erst die Filter machen ein einfaches Videomikroskop zu einem Fluoreszenzmikroskop. Das Prinzip ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Fluoreszenzmikroskopie zählen auch fortgeschrittene Techniken, wie die konfokale Mikroskopie, 2-Photonen-Mikroskopie oder nicht-lineare Ramanspektroskopie. Detaillierte Informationen zu den optischen Filtern finden Sie unter Fluorophore und Filter für die Fluoreszenzmikroskopie.

Bei den typischen Proben der Fluoreszenzmikroskopie ist die Quantenausbeute sehr gering. Das heißt, nur ein Bruchteil der Photonen mit passender Anregungsenergie erzeugen auch tatsächlich eine Fluoreszenzemission. Aus diesem Grund ist meist eine sehr intensive Beleuchtung notwendig. Das stellt einige zusätzliche Anforderungen an den Filter. Hart beschichtete Filter, mit ihren hohen optischen Dichten, und dichroitische Filter sind ideal geeignet, um die unerwünschten Wellenlängen einfach und effizient zu blocken und Probleme durch Streulicht zu vermeiden. Der dichroitische Strahlteiler und der Emissionsfilter sind die beiden wichtigsten Filter des Systems. Der dichroitische Filter reflektiert die kürzeren Wellenlängen, die in der Regel Fluorophore anregen, zur Probe und transmittiert längere Wellenlängen, wozu auch das Emissionsband zählt, so dass das Signal den Sensor erreichen kann. Gemeinsam verhindern diese Filter, dass Energie, die nicht im Emissionsband liegt, sowie Streulicht den Sensor erreichen. Die wichtigsten Parameter eines Filters sind die Zentralwellenlänge, die Transmission, die optische Dichte und die Bandbreite, die mitunter auch als Halbwertsbreite (FWHM) bezeichnet wird. Mehr Informationen über Filter finden Sie unter Optische Filter.

Abb.2: Typische Filteranordnung für die Fluoreszenzmikroskopie

Optische und mechanische Komponenten

Zum Aufbau eines präzisen Fluoreszenzmikroskops sind verschiedene optische Komponenten und Mechaniken zur stabilen Montage erforderlich. Um die Auswahl so einfach wie möglich zu gestalten, enthält Tabelle 1 eine komplette Komponentenliste mit detaillierten Empfehlungen der Produkte, deren Produktnummern und Stückzahl.

Abbildung 3 zeigt das Fluoreszenzmikroskop, das sich mit den Komponenten aus Tabelle 1 realisieren lässt. Von oben nach unten besteht die Baugruppe aus einer ½" CMOS-Farb-USB-Kamera EO-3112C #59-367 und aus den C-Mount Adaptern #58-329 und #55-743 zur Befestigung der MT1-Tubuslinse #54-774. Im Raum zwischen der Tubuslinse und dem Objektiv verlaufen die optischen Strahlen parallel. Dies ist ein Vorteil der unendlich korrigierten Systeme und erlaubt den Einbau von optischen Komponenten ohne Verzeichnung oder Aberrationen. Das Filterrad mit sechs Positionen
#56-658 erlaubt einen schnellen und einfachen Wechsel zwischen verschiedenen Emissionsfiltern. Der dichroitische Strahlteiler reflektiert das weiße Licht des MI-150 Beleuchtungsgerätes zur Probe und verhindert gleichzeitig, dass unerwünschtes Licht vom Objektiv wieder auf den Sensor fällt. Zu guter letzt bringt eine Reihe mechanischer Komponenten die Probe in den Fokus des unendlich korrigierten 10x M-Plan-Apo-Objektivs #59-877. Abbildung 4 zeigt das Filterrad und die Anordnung hinter der Tubuslinse im Detail.

Abb.3: Beispielkonfiguration für ein Fluoreszenzmikroskop

Abb.4: Nahaufnahme des Filterrads im Bereich des parallelen Strahlengangs

Digitale Videomikroskope sind leistungsfähige optische Werkzeuge für die Inspektion sowohl in der Industrie, als auch in der Biologie. Sie können so einfach oder komplex aufgebaut werden, wie es die Anwendung verlangt, von einfachen Systemen mit vier bis zu komplexeren Systemen mit bis zu zwölf Komponenten. Systemen mit mehr als zwölf Komponenten benutzen in der Regel komplexe Filtermethoden und Mechaniken, um die Filter im Strahlengang zu platzieren. Wenn zwischen Kamera und Objektiv Optikelemente eingebracht werden müssen, ist ein unendlich korrigiertes System aus sieben Komponenten die ideale Wahl, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie.