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Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven
Edmund Optics Inc.

Grundlagen zu Mikroskopen und Mikroskopobjektiven

Dies ist der Abschnitt 9.3 des Leitfadens zur Bildverarbeitung.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie handelt es sich um eine Mikroskopietechnik, die die durch Fluorophore hervorgerufene Fluoreszenz nutzt, im Gegensatz zur Absorption, Streuung oder Reflexion. Ein Fluorophor (oder Fluorochrom) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der zur Markierung von Proteinen, Geweben und Zellen für die Untersuchung mittels Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird. Ein Fluorophor funktioniert durch Absorption von Energie bestimmter Wellenlängen, die gemeinhin als Anregungsbereich bezeichnet werden, und durch Wiederabgabe dieser Energie in einem anderen spezifischen Wellenlängenbereich, dem Emissionsbereich.

Fluoreszenzmikroskopie-Systeme wie ein Epifluoreszenzmikroskop können einfach sein, während konfokale oder Multiphotonen-Systeme sehr komplex sein können. Alle Fluoreszenzmikroskope haben jedoch das gleiche Grundkonzept
: Anregungsenergie beleuchtet eine Probe, die eine schwache, aber quantifizierbare Emissionsenergie freisetzt. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen haben nicht dieselbe Zentralwellenlänge. So können spezielle Filter den Gesamtkontrast und das Signal erhöhen.

Ein typischer Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops.
Abbildung 1: Ein typischer Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops.

Das grundlegendste Konzept und Schema ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine Filteranordnung besteht aus drei Filtertypen: einem Anregungsfilter, einem dichroitischen Filter und einem Emissionsfilter.

Filter #1: Anregungsfilter

Der Anregungsfilter wird in den Beleuchtungsgang eines Fluoreszenzmikroskops eingesetzt und filtert alle Wellenlängen der Lichtquelle mit Ausnahme des Fluorophor-Anregungsbereichs heraus. Die Mindesttransmission des Filters bestimmt die Helligkeit und Brillanz der Bilder. Es wird empfohlen, für jeden Anregungsfilter eine Mindesttransmission von 40% vorzusehen, so dass die Transmission im Idealfall >85% beträgt. Die Bandbreite des Anregungsfilters sollte vollständig innerhalb des Anregungsbereichs des Fluorophors liegen, so dass die Zentralwellenlänge (CWL) des Filters so nahe wie möglich an der Wellenlänge der Spitzenanregung des Fluorophors liegt. Die optische Dichte (OD) des Anregungsfilters bestimmt den Kontrast zum Bildhintergrund; OD ist ein Maß dafür, wie gut ein Filter die Wellenlängen außerhalb des Übertragungsbereichs oder der Bandbreite blockiert. Es wird eine OD von mindestens 3,0 wird empfohlen, ideal ist jedoch eine OD von 6,0 oder mehr.

Filter #2: Dichroitischer Filter oder Strahlteiler

Der dichroitische Filter wird in einem Winkel von 45° zwischen dem Anregungsfilter und dem Emissionsfilter angeordnet und reflektiert das Anregungssignal zum Fluorophor, während er das Emissionssignal zum Detektor durchlässt. Ideale dichroitische Filter und Strahlteiler haben scharfe Übergänge zwischen maximaler Reflexion und maximaler Transmission, mit einer Reflexion von >95% für die Bandbreite des Anregungsfilters und einer Transmission von >90% für die Bandbreite des Emissionsfilters. Bei der Auswahl des Filters ist die Schnittwellenlänge (λ) des Fluorophors zu berücksichtigen, um das Streulicht zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzbildes zu maximieren.

Filter #3: Emissionsfilter

Der Emissionsfilter wird im Bildweg des Fluoreszenzmikroskops platziert und filtert den Anregungsbereich des Fluorophors heraus, während er den Emissionsbereich durchlässt. Die gleichen Empfehlungen wie für Anregungsfilter gelten auch für Emissionsfilter: Mindesttransmission, Bandbreite, OD und CWL. Ein Emissionsfilter mit der idealen Kombination aus CWL, Mindesttransmission und OD liefert die hellstmöglichen Bilder mit der größtmöglichen Blockierung und gewährleistet die Erkennung der schwächsten Emissionssignale. 

Typischer Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops.
Abbildung 2: Allgemeine Fluorophor-Spektralkurve.

Abbildung 2 zeigt ein typisches Anregungs- und Emissionsprofil. Die Absorptions- und Emissionsprofile haben gemeinsame Wellenlängen, was ein Grund dafür ist, dass hochwertige Filter mit hoher Transmission, schmaler Bandbreite, hoher OD und scharfen Cut-on- und Cut-off-Bändern benötigt werden. Die Verwendung von Filtern minderer Qualität kann letztendlich die Probe, das Präparat oder die teuren Sensoren beschädigen. Wenden Sie sich an uns, damit wir Ihnen bei der Auswahl der geeigneten Filter für Ihre Anwendung helfen können.

Wie stellt Edmund Optics Filterpaare zusammen?

Edmund Optics® bietet Dutzende von vorrätigen und versandfertigen optischen Filtern, die zu den Anregungs- und Emissionsbereichen der einzelnen spezifizierten Fluorophore passen. Bei uns können Sie ganz einfach Filter anhand des gewünschten Fluorophors suchen, Suchen Sie einfach nach den empfohlenen Filtern, die der Wellenlänge der Peak-Anregung bzw. Peak-Emission entsprechen und bei dieser Wellenlänge eine größtmögliche Transmission aufweisen. Für Fluoreszenzmikroskopie-Anwendungen mit mehreren Fluorophoren, Laserquellen, alternativen dichroitischen Filtern oder Strahlteilern oder für Anwendungen, die komplexer sind als typische Fluoreszenzmikroskop-Aufbauten, kontaktieren Sie uns, um Ihre Spezifikationen zu besprechen.

Weiterführende Informationen
 Anwendungshinweis
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