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Fluorophore und Filter für die Fluoreszenzmikroskopie
Edmund Optics GmbH

Fluorophore und Filter für die Fluoreszenzmikroskopie

Ein Fluorophor ist ein fluoreszierender Farbstoff, der in der Fluoreszenzmikroskopie als Marker zur Einfärbung von Proteinen, Geweben und Zellen verwendet wird. Ein Fluorophor absorbiert Energie eines bestimmten Wellenlängenbereichs, im Allgemeinen bezeichnet als "Anregungsbereich" und strahlt diese Energie in einem anderen Wellenlängenbereich wieder ab, in der Regel bezeichnet als "Emissionsbereich".

A Generalized Fluorophore Spectral Curve
Abb.1: Allgemeine Fluorophor-Spektralkurve

Im Allgemeinen wird ein Fluorophor durch eine hochfrequente Beleuchtung angeregt, also Wellenlängen im ultravioletten, violetten oder blauen Spektrum, und strahlt die Energie mit etwas niedrigeren Frequenzen wieder ab, d.h. Wellenlängen im grünen, roten oder nahen Infrarotbereich des Spektrums. Jedes Fluorophor besitzt eine Resonanzwellenlänge, bei der es Energie am effizientesten absorbiert und eine bestimmte Wellenlänge, bei der die maximale Menge der absorbierten Energie wieder abgestrahlt wird (in unserer interaktiven Filtertabelle als "Peak Emission" / "Peak Excitation" bezeichnet). Die größtmögliche Transmission bei diesen Wellenlängen ist ein wichtiges Kriterium bei der Auswahl optischer Filter für die Fluoreszenzmikroskopie, wenn die klarsten und brilliantesten Bilder entstehen sollen.

Der typische Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops enthält drei Filter. Abbildung 2 zeigt das Funktionsprinzip.

FILTER #1: Anregungsfilter

Der Anregungsfilter wird hinter der Beleuchtung des Fluoreszenzmikroskops platziert. Seine Aufgabe ist es, alle Wellenlängen der Lichtquelle auszufiltern, die nicht im Anregungsbereich des zu prüfenden Fluorophors liegen. Die Transmission im Durchlassbereich des Filters entscheidet über Helligkeit und Brillanz der Bilder. Edmund Optics® empfiehlt eine Transmission von mindestens 40 % für jeden Anregungsfilter, ideal sind Werte über 85 %. Die Bandbreite des Anregungsfilters sollte möglichst exakt mit dem Anregungsbereich des Fluorophors übereinstimmen, wobei die Zentralwellenlänge idealerweise mit dem Resonanzmaximum zusammenfällt. Die optische Dichte (OD) des Anregungsfilters ist ein Maß für die Blockung der unerwünschten Wellenlängen und bestimmt damit den Kontrast zum Hintergrundbild. Edmund Optics® empfiehlt eine optische Dichte von mindestens 3,0, besser ist OD6,0. Ein optischer Filter mit der idealen Kombination aus Zentralwellenlänge, Transmission und optischer Dichte ergibt die hellsten und kontrastreichsten Bilder und erlaubt so die Erkennung schwächster Emissionssignale.

A Typical Fluorescence Microscope Setup
Abb.2: Typischer Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops

FILTER #2: Emissionsfilter

Der Emissionsfilter wird im Bildweg des Fluoreszenzmikroskops platziert. Seine Aufgabe ist es, die übrigen Anregungswellenlängen der Beleuchtung herauszufiltern und nur das emittierte Licht des Fluorophors durchzulassen. Für Emissionsfilter gelten die gleichen Empfehlungen für Transmission, Bandbreite, optische Dichte und Zentralwellenlänge wie für Anregungsfilter. Auch hier führt nur eine sorgfältige Filterauswahl dazu, dass auch schwache Signale zuverlässig erkannt werden können.

FILTER #3: Dichroitischer Farbfilter oder Strahlteiler

Zwischen Anregungs- und Emissionsfilter wird unter 45° entweder ein dichroitischer Filter oder ein Strahlteiler platziert. Seine Aufgabe ist es, das Anregungssignal zum zu prüfenden Fluorophor zu reflektieren und das Emissionssignal zum Detektor zu übertragen. Ein idealer dichroitischer Filter oder Strahlteiler besitzt einen scharfen Übergang zwischen maximaler Reflexion und maximaler Transmission, mit einer Reflektivität von über 95 % über die Bandbreite des Anregungsfilters und einer Transmission von mehr als 90 % über die Bandbreite des Emissionsfilters. Bei der Auswahl des Filters sollte man den Überlapp zwischen Anregungs- und Emissionsbereich des Fluorophors bedenken, um Streulicht zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzbildes zu maximieren. Die Auswahl eines geeigneten dichroitischen Filters oder Strahlteilers ist nicht einfach, aber Edmund Optics® ist gerne bereit, Sie bei der Auswahl des richtigen optischen Filters für Ihre Anwendung zu unterstützen. Bitte nehmen Sie Kontakt mit uns auf, um Ihre Anforderungen durchzusprechen.

Wie stellt Edmund Optics Filterpaare zusammen?

Edmund Optics® bietet Dutzende ab Lager versandfertige optische Filter , die zu den Anregungs- und Emissionsbereichen der verbreitetsten Fluorophore passen. Bei uns können Sie ganz einfach Filter anhand des gewünschten Fluorophors suchen, wir haben den passendsten Filter bereits für Sie ausgewählt. Bei Fluoreszenzmikroskopieanwendungen mit mehreren Fluorophoren, Laserlichtquellen, alternativen dichroitischen Filtern oder Strahlteilern oder Anwendungen, die komplexer sind als normale Fluoreszenzmikroskope, nehmen Sie bitte Kontakt mit uns auf, um Ihre Anforderungen durchzusprechen.


Anregungs-/Emissionsinterferenzfilter nach Filterfamilie

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